應(yīng)用案例|奧譜天成ATF4500熒光分光光度法在藥材方面的應(yīng)用
熒光分光光度法廣泛應(yīng)用于藥材研究
前言
當(dāng)今社會隨著群眾思想的轉(zhuǎn)變，中藥逐漸又成為了大眾熱點。目前中藥市場魚龍混雜，假中藥、劣質(zhì)藥層出不窮。中藥市場中藥質(zhì)量評價和質(zhì)量控制是保證中藥有效性、安全性的手段，也是一直困擾中藥現(xiàn)代化發(fā)展的瓶頸。首先，中藥的質(zhì)量受多環(huán)節(jié)多因素影響。中藥材種類繁多、產(chǎn)地分散，加上生長環(huán)境、采收季節(jié)、炮制工藝等因素，造成所含化學(xué)成分的差異。
隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，熒光分析法在中藥材鑒別上的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，中藥材中含有多種具有熒光特性的化學(xué)物質(zhì)，如環(huán)狀化合物、芳香化合物等，葉類藥材因在采收、加工、運(yùn)輸、儲存的過程中較易皺縮破碎，性狀鑒別較為困難；又因葉類藥材含有較多的鞣質(zhì)、葉綠素等成分，一般理化鑒別也較為困難。可以通過熒光法簡便快速鑒別。
二、熒光分光光度法鑒別番瀉葉藥材和大青葉藥材
番瀉葉是一種常見的導(dǎo)瀉劑，被廣泛運(yùn)用于各種茶飲。其來源多為進(jìn)口，國內(nèi)產(chǎn)量較少，導(dǎo)致偽劣品泛濫。大青葉目前應(yīng)用混亂，市場上的品質(zhì)良莠不齊。且隨著大青葉被北京市藥品監(jiān)督管理局列為預(yù)防甲型H1N1的藥物之列，大青葉的用量劇增，市面上出現(xiàn)大量偽品混淆使用的現(xiàn)象。
王鑫瑞等人通過對番瀉葉和大青葉粉碎，加入水、稀乙醇、甲醇、稀鹽酸、氫氧化鈉溶液，經(jīng)過超聲和離心，獲得浸出液。通過查閱資料后將激發(fā)波長設(shè)置為254nm和365nm
圖一二大青葉不同溶劑超聲激發(fā)波長254nm熒光光譜
番瀉葉不同溶劑超聲激發(fā)波254nm熒光光譜
圖三四大青葉不同溶劑超聲激發(fā)波長365nm熒光光譜
番瀉葉不同溶劑超聲激發(fā)波長365nm熒光光譜
本研究發(fā)現(xiàn)，兩種藥材的浸出液經(jīng)熒光分光光度計可得到不同的圖譜。激發(fā)波長254nm時，大青葉水、鹽酸浸出液有兩個熒光峰，番瀉葉均只有一個熒光峰；激發(fā)波長為365nm時，番瀉葉甲醇、氫氧化鈉、乙醇浸出液有兩個熒光峰，大青葉均只有一個熒光峰。且大青葉熒光峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于番瀉葉。
三、熒光分光光度法測定枸杞中核黃素濃度
核黃素又稱維生素B2，英國化學(xué)家布魯斯首先從乳清中發(fā)現(xiàn)的。核黃素是維持機(jī)體正常的必需營養(yǎng)物質(zhì)，具有多種生理功能，能促進(jìn)多種有機(jī)物的代謝，促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育，它參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的代謝，還與動物視覺有關(guān)，是動物必需的營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)今社會最廣泛用來測定核黃素濃度的方法是熒光分光光度法，熒光法利用核黃素在pH4～9的環(huán)境下，激發(fā)波長在440～500nm的范圍內(nèi)產(chǎn)生黃綠色熒光，且該熒光強(qiáng)度與核黃素濃度成正比的原理對核黃素進(jìn)行測定熒光強(qiáng)度，方法操作簡單易行。
宋吉英等人通過對枸杞加入鹽酸溶液，經(jīng)過離心之后取上層清液過濾。濾液倒入比色皿中，設(shè)置參數(shù)：
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波長
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掃描范圍
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狹縫寬度
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掃描速度
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延遲時間
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重復(fù)次數(shù)
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EX-490.0nm，EM-512.0nm
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EX-300~600nm，EM-300~600nm
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EX-2.5nm，EM-2.5nm
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300nm／Min
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0s
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1次
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圖五 不同鹽酸溶液提取樣品的激發(fā)波長熒光強(qiáng)度
圖六 不同料液比提取樣品的激發(fā)波長熒光強(qiáng)度
圖七 不同攪拌時間提取樣品的激發(fā)波長熒光強(qiáng)度
通過不同對照組實驗，課題組獲得了**實驗條件，課題組準(zhǔn)確稱取1.000g核黃素標(biāo)品用0.5％的醋酸定容為1000ml做為母液，移取母液分別配制0.2，0.4，0.6，0.8，1μg/ml的核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以核黃素濃度為橫坐標(biāo)，激發(fā)波長熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Ｆ＝15.998ｃ＋0.7684，Ｆ為熒光強(qiáng)度，ｃ為核黃素濃度，線性相關(guān)系數(shù)ｒ２＝0.9993。
四、產(chǎn)品推薦
圖八 ATF4500 熒光分光光度計
1)綜合概述：熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對這些參數(shù)的測定，不但可以做一般的定量分析，而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化，從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。可以用于液體和固體樣品的掃描。
針對于隨著使用年限的增長，儀器燈源性能下降的問題，ATF4500采用性能優(yōu)越的氙燈，同時改進(jìn)了燈電源，光源亮度得到了提升，并有效延長氙燈的使用壽命至1000小時。延長燈泡更換周期可降低耗材成本，減輕燈泡更換等作業(yè)負(fù)擔(dān)。搭配上凝聚了奧譜天成長期發(fā)展的高超技術(shù)與全新科技，科學(xué)設(shè)計的光路系統(tǒng)，確保熒光分析所追求的優(yōu)越精度與出類拔萃的測定精度，確保結(jié)果準(zhǔn)確的同時，高速的三維熒光采集也能保證高速的掃描速度，不僅如此還有多種配件可供選擇，滿足用戶各種測定需求。
這款產(chǎn)品配置了奧譜天成特有的簡潔直觀的操作頁面，從用戶的角度出發(fā)，智能一體化的系統(tǒng)，只需稍微培訓(xùn)，就能讓用戶快速上手。數(shù)據(jù)處理方面，可聯(lián)機(jī)通過譜圖處理來更好地整理數(shù)據(jù)。
2)產(chǎn)品選型
型號 |
波長范圍
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ATF4500 |
185-900nm |
ATF4500-17 |
185-1700nm |
ATF4500-TM |
185-900nm，帶時間分辨功能，可測量熒光壽命150ps~100ns |
ATF4500-17-TM |
185-1700nm，帶時間分辨功能，可測量熒光壽命150ps~100ns |
3)產(chǎn)品參數(shù)
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型號
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ATF4500
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ATF4500-17
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波長范圍
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185~900nm
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185~1700nm
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掃描速度
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30、60、240、1,200、2,400、12,000、30,000、60,000nm/min
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30、60、240、1,200、2,400、12,000、30,000、60,000nm/min
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靈敏度
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水拉曼峰處噪聲：S/N>800(RMS)
背景最低噪聲：S/N>7500(RMS)
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水拉曼峰處噪聲：S/N>800(RMS)
背景最低噪聲：S/N>7500(RMS)
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波長準(zhǔn)確度
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±1.0nm
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±1.0nm
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光源
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150W氙燈
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150W氙燈
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光譜帶寬
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激發(fā)：1.0/2.5/5/10nm可調(diào)
發(fā)射：1.0/2.5/5/10/20.0nm可調(diào)
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激發(fā)：1.0/2.5/5/10nm可調(diào)
發(fā)射：1.0/2.5/5/10/20.0nm可調(diào)
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分辨率
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1.0nm
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1.0nm
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平均采樣時間
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熒光：0.0125-999sec
磷光：1μsec-10sec
生物/化學(xué)發(fā)光：40sec-10sec
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熒光：0.0125-999sec
磷光：1μsec-10sec
生物/化學(xué)發(fā)光：40μsec-10sec
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探測器
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PMT
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PMT和InGaAs
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通訊接口
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μSB2.0
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μSB2.0
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波長重復(fù)性
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±0.2nm
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±0.2nm
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工作濕度
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45-80％
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45-80％
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工作溫度
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10-35℃
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10-35℃
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參考文獻(xiàn)
王鑫瑞,馮帥,李峰.番瀉葉和大青葉藥材的熒光鑒別[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2021,45(01):125-132.DOI:10.16294/j.cnki.1007-659x.2021.01.020
宋吉英.熒光分光光度法測定枸杞中核黃素含量[J].化學(xué)世界,2012,53(12):720-722.DOI:10.19500/j.cnki.0367-6358.2012.12.005
