在不同PH值中，用拉曼光譜儀檢測纖維二糖酶主鏈構象是否有異同？
拉曼光譜是一種散射光譜，目前已廣泛應用于材料、化工、石油、高分子、生物、環保、地質等領域。拉曼光譜是研究分子振動的一種光譜方法，它可以提供關于分子內部各種簡正振動頻率及有關振動能級的情況，從而可以用來鑒定分子中存在的官能團。它的譜線強度取決于相應的簡正振動過程中極化率變化的大小。
蛋白質受外界因素如溫度、pH、紫外輻射等影響而發生構象變化，即分子內部原有的高度規則性的空間排列和折迭方式發生變化，致使原物理、化學、生物性質部分或全部喪失。目前，在蛋白質的構象研究中，特別是溶液中蛋白質大分子空間結構與功能相互關系的動態研究中，激光拉曼光譜已成為很有前景的新技術。從蛋白質的拉曼光譜可以得到有關它的芳香族組成氨基酸的信息，還能進一步得到二級結構的信息。有關利用拉曼光譜分析多肽及蛋白質構型的研究國內外均有報道。Ellepola等吲研究了大米球蛋白在各種處理方式下拉曼光譜的變化。周殿鳳等利用拉曼光譜分析、研究了紫外輻射對牛血清白蛋白影響。余多慰等對綠色木霉(Trichoderma viride)纖維素酶中的CBH 11(Cel—lobiohydrolaseⅡ)在固態以及兩種pH的液態中酶分子的側鏈構象與側鏈環境狀態進行了拉曼分析，揭示了活性中心酪氨酸的作用。
本實驗室在綠色木霉產纖維素酶的發酵過程中，觀察到纖維二糖酶(Cellobiase，CB)受pH的影響顯著，是限制纖維素水解的重要因素。為此，本文采用拉曼光譜分析了纖維二糖酶經不同pH處理后蛋白構象的變化，并對其主要的碳鏈與側鏈構象進行研究。
1 材料與方法
1.1材料和儀器
采用本實驗室分離得到的纖維二糖酶(由綠色木霉產生)，濃度為0.1 g/L。激光顯微拉曼光譜儀(invia+Reflex)，英國Renishaw公司生產。
1.2實驗方法
取酶液，用HCl調節pH為5.0和2.0，測定纖維二糖酶酶活。酶活測定按文獻[6]進行。另取酶液在室溫(22℃)進行拉曼光譜分析。激發光波長785 nm，發射功率300 mW。每個樣品都重復掃描3次以上，各樣品的拉曼譜圖都由計算機作信號累加平均并繪圖輸出，峰位誤差小于±3cm-1
2 結果與討論
2.1 pH對纖維二糖酶酶活的影響
在pH 5.0和pH 2.0下測定纖維二糖酶酶活，將pH 2.0調回至5.0之后再測定酶活，以pH 5.0時測定酶活為100%。
纖維二糖酶在pH 2.0時酶活只有pH 5.0的1.0%，即使回調至pH 5.0之后，酶活也沒有恢復，說明在強酸性條件下，纖維二糖酶構象上有所變化，致使酶活發生不可逆變化。為此對纖維二糖酶在pH 5.0和pH 2.0下進行拉曼光譜分析，考察其構象變化。
2.2 pH對纖維二糖酶主鏈構象的影響
pH 5.0和pH 2.0下纖維二糖酶的拉曼譜圖如圖1，其拉曼頻移和歸屬指認見表1。
纖維二糖酶主鏈的構象主要由酰胺I和酰胺Ⅲ的拉曼特征峰確定，酰胺I拉曼特征峰位置為：口-螺旋結構：1 645--一1 660 em～;p折疊結構：1 665"～1 680 emq,p-回折：1 680～1 690 em～;無規則卷曲結構：1 660～1 670 cm～。酰胺Ⅲ拉曼特征峰位置為：儼螺旋結構：1 265～1 300 cm～;p折疊結構：1 230 1 240 cm～;p回折：1 305 cm～;無規則卷曲結構：1 240 1 260 cm～。‘在pH 5.0的纖維二糖酶溶液中，酰胺I譜帶出現在1 645 cm-1和1 666 am一，酰胺Ⅲ譜帶分別出現在1 240 cm_1和1 281 cm.‘。另外在890 cm_1出現了C—C伸縮振動吸收峰，1 063 cm.1和1 140cm-1出現了C—N伸縮振動峰，1 466 cm叫出現了C—H伸縮振動峰。由此表明，在pH 5.0溶液中的纖維二糖酶主要含有a一螺旋結構和無規則卷曲結構。
在pH 2.0的纖維二糖酶溶液中，酰胺I譜帶出現在1 658 cm～，酰胺Ⅲ譜帶出現在1 288 cm～。而在pH 5.0時出現的酰胺I譜帶1 666 cm-1和酰胺Ⅲ譜帶1 240 cm_1并沒有很強的吸收峰。這兩個譜帶正是無規卷曲結構對應的譜帶，說明在pH 2.0的時候，纖維二糖酶中無規則卷曲結構被破壞了。另外在889 ClTI_1出現了C—C伸縮振動吸收峰，1 126 cm_1出現的C—N伸縮振動峰和1 476 cm叫出現了C—H伸縮振動峰，都與pH 5.0時峰位置有所不同，而且峰強也有所下降。由此表明，在pH2.0的纖維二糖酶溶液中主要含有口一螺旋結構。pH從5.0到2.0的變化使纖維二糖酶的結構中的無規則卷曲結構受到很大影響，口一螺旋結構也受到一定影響，酶構象變化，穩定性下降。
2.3 pH對纖維二糖酶側鏈環境的影響
蛋白質某些殘基的側鏈拉曼光譜對環境變化敏感。由酪氨酸對羥苯基環的呼吸振動和環平面外彎曲振動的倍頻之間的費米共振引起的850 cm叫和830 cm_1左右的特征峰是構象靈敏的譜線[7]，隨側鏈微環境而變化。當強度比J。。。/J啪≥1時，該酪氨酸是“暴露的”;J啪/J啪<1時，該酪氨酸則是“埋藏的”。在pH 5.0時其峰位為834 cm-1和851 cm～，而在851 cm.1的峰強明顯低于834 cm.1的峰強，可得Jsso/is。o<1;而在pH 2.0時其峰位為833 cm.1和843 cm～，而在843 ca2_1的峰強明顯高于833Ca2-1的峰強，可得J啪/f啪≥1。由此可知，纖維二糖酶溶液在pH 5.0時酪氨酸為“埋藏式”，當pH2.O時為“暴露式”。在色氨酸殘基的一系列譜帶中，1 361 cm-1譜帶對于環境和聚集狀態的改變是敏感的。當色氨酸殘基的吲哚環處于“埋藏式”時，該譜線呈尖銳的峰形。在pH 5.0的纖維二糖酶溶液中，其峰位為570，1 364，1 556和1 620 cm_1;在pH 2.0的纖維二糖酶溶液中，其峰位為571，1 361，1 557和1 617 cm～。1 364 cm_1的峰強比1 361 cm-1的峰強高出很多，而且是尖銳的峰形，而1 361 cm_1的峰形為不明顯的肩峰，可見纖維二糖酶在pH 5.0時色氨酸為“埋藏式”，而在pH為2.0時是“暴露式”。另外在500～550 cm-1內并沒有出現強的S—S伸縮振動譜帶，這可能說明纖維二糖酶并不含有二硫鍵。
3 結論
蛋白質(酶)為由氨基酸連接成鏈的肽鍵組成，在肽鏈的不同部分之間，存在著靜電的相互作用。靜電吸引有助于維持蛋白質的構象，靜電排斥可以使蛋白質的穩定性下降，導致構象松散或變化。從本實驗測定的拉曼光譜結果來看，纖維二糖酶在pH 5.0的溶液中，其結構為口一螺旋和無規則卷曲;在pH 2.0時則主要為a一螺旋結構，其主鏈構象中的無規則卷曲發生較大變化，口一螺旋也受到一定影響。纖維二糖酶側鏈中的酪氨酸和色氨酸在pH5.0時均為“埋藏式”，而在pH 2.0時均為“暴露式”。此外，在500～550 cm_1并沒有出現強的S—S伸縮振動譜帶，這可能說明纖維二糖酶并不含有二硫鍵。結合在兩種pH情況下纖維二糖酶酶活的分析，表明pH變化對纖維二糖酶構象的改變是造成酶活差異的主要原因，這對于進一步分析纖維二糖酶的活性中心與其構象的關系具有重要的意義。
